水迷宫-左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马神经元突触功能可塑性相关蛋白的影响 - 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司

pk10计划

产品搜索
 

北京智鼠多宝生物科技有限责任公司
联系人:孟先生
联系电话:010-61210147
传真号码:010-83551731
移动电话:15313005355   18612351088
公司地址:北京市大兴区黄村东大街38号院3号楼11层1112室火神庙商业中心D座1112室
Email:zhishuduobao@126.com
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4

水迷宫-左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马神经元突触功能可塑性相关蛋白的影响

左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马神经元突触功能可塑性相关蛋白的影响

杜青 1,赵洪庆 1,王宇红 1,2*,徐雅岚 1,杨蕙 2,孟盼 1

(1.湖南省中药粉体与****省部共建国家重点实验室培育基地, 长沙 410007;2.湖南中医药大学**附属医院,长沙 410007)

 摘要:目的 针对 NR 受体亚型及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的表达情况,探索左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马神经元突触功能可塑性的影响。方法 复制糖尿病并发抑郁症大鼠模型并随机分为 4 组:模型组,阳**组(二甲双胍 0.18 g·kg-1+盐酸氟西汀 1.8 mg·kg-1),左归降糖解郁方高、低剂量组(32.82,8.20 g·kg-1),以正常大鼠为空白对照组。采用 Morris 水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力,Western-blotting 实验检测大鼠海马 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的表达情况。结果 与空白对照组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长,空间探索时间减少(P<0.05),NR 受体亚型NR2A、NR2B CaMKII、SynGAP 的表达明显减少(P<0。01);与模型组比较,阳**组和左归降糖解郁方高剂量组逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),空间探索时间显著增加(P<0。05),NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的表达明显增多(P<0。05 或0。01)。结论 左归降糖解郁方可以明显增强糖尿病并发抑郁症大鼠的学习记忆能力,改善认知功能障碍,缓解抑郁症状, 该作用可能与调节海马 NR 受体亚型 NR2A、NR2B 及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的表达,保护海马神经元突触功能可塑性有关。

关键词:糖尿病并发抑郁症;左归降糖解郁方;NR2A;NR2B;CaMKII;SynGAP

 

糖尿病作为一种***障碍性慢性**正严重影响着人类的生活、健康和生存。全世界约有3.47 亿糖尿病患者,而糖尿病并发抑郁症(diabetes mellitus with depression , DD) 的发生率为8.5%~71.4%[1],抑郁症的并发大大增加了糖尿病的致残率和致死率。目前,针对 DD 的研究多集中于临床试验,极少数涉及其分子机制,极大地限制了** DD 特效药的研究及开发。本课题组前期研究发现,DD 模型大鼠脑内谷氨酸异常活化,海马出现明显病理结构损伤,海马神经元树突、轴突复杂性降低[2],广泛分布于海马的 NR 受体活化异常,学习记忆功能减弱。有文献报道,离子形谷氨酸受体 NR 异常活化可调节 CaMK Ⅱ、SynGAP,影响长时程增强(long-term potentiation, LTP)和长时程减弱(long-term decline,LTD),改变海马神经元突触功能可塑性[3]。而大脑的学习记忆功能与海马神经元突触可塑性密切相关。因此, 本实验通过检测 NR 受体亚型及其下游分子CaMKII、SynGAP 的表达情况,探索左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马神经元突触功能可塑性的保护作用机制。

1 材料

1。1 仪器与试药

OneTouchⅡ型血糖仪及血糖试纸(美国强生公司);HI1210 型水浴锅(Leica 公司);Mini protean 3 cell 型电泳仪(BIO-RAD 公司);PS-9 型电转仪 (大连竞迈科技有限公司);MK3 型酶标仪(芬兰雷勃公司) ;吉尔森 P 型移液器(Pipetman) DB001Morris 水迷宫(北京智鼠多宝生物科技有限责任公司)。

左归降糖解郁方[4]原材料由湖南中医药大学**附属医院制剂科按比例水煎浓缩后制成口服 100 mL,建立了一测多评的质量控制方法,其主要药效成分分别为黄芪甲苷≥30 µg·mL-1、贯叶金丝桃素≥18 µg·mL-1、姜黄素≥0.4 mg·mL-1丹酚酸 B≥1.2 mg·mL-1、丹皮酚≥0.2 mg·mL-1。盐酸二甲双胍片(湖南湘雅制药有限公司,批号: 1402115,规格:0.25 g);盐酸氟西汀胶囊(法国Patheon,批号:2087A,规格:20 mg);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美国 Sigma 公司,批号: 126A038,规格:100 mg),Western blotting **印迹法蛋白抗体 NR2A(批号:Ab14596)、NR2B(批号: Ab65783) CaMK Ⅱ ( 批号: Ab134041) 和SynGap(批号:Ab3344)均购于 Abcam 公司;BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo 公司,批号:PICPI23223)pk10计划 RIPA 组织细胞快速裂解液(上海基尔顿生物,批号:BYL40825)。

1。2 动物

SPF 级,,SD 大鼠 50 只,体质量 180~220 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,生产许可证号: SCXK( 湘)2013-0004 , 合格证号:pk10计划 43004700004535。

2 方法

2.1 糖尿病并发抑郁症动物模型的制备[5]

SD 大鼠连续 14 d 每天定时灌胃高脂乳剂(10 mL·kg-1)后,大鼠禁食不禁水 24 h,尾静脉一次性注射溶于新鲜配制、4 ℃保存的枸橼酸缓冲液(0.1 mol·L-1、pH4.5) STZ 溶液(38 mg·kg-1),造模 3 d 后,大鼠禁食不禁水 12 h,测定空腹血糖, 选取空腹血糖≥16.00 mmol·L-1 的大鼠进行 28 d 慢性不可预测性应激。刺激因素包括昼夜颠倒24 h、45°倾笼 24 h、4 ℃冰水浴 5 min、45 ℃热刺 5 min、噪音 8 h、潮湿垫料(每笼 200 mL,24 h)、夹尾 1 min。每天进行 1 种,同种刺激不连续出现。

2。2 分组与给药

将筛选出来的糖尿病模型大鼠按体质量随机分为 4 组:模型组、阳**组(二甲双胍 0.18 g·kg-1+盐酸氟西汀 1.8 mg·kg-1)和左归降糖解郁方高、低剂量(32.82,8.20 g·kg-1)组,各组大鼠慢性不可预测应激造模的同时灌胃给药 28  d。另取正常大鼠10 只作为空白对照组,空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水。

2。3 Morris 水迷宫实验

将平台置于 D 象限,Morris 水迷宫内注入刚好没过平台 2 cm 的清水(水温 23~25 ℃),撒入适量脱脂奶粉减少光反射。第 1~4 天定位航行实验检测大鼠学习能力,从不同的方位将大鼠面向池壁放入,观察 60 s 内大鼠爬上平台的逃避潜伏期(escape latency,EL),若 60 s 内还未爬上,将大鼠引导至台上,并记录 EL 60 s。第 5 天空间探索实验检测大鼠记忆能力,撤走平台,大鼠自对立象限放入,记录 60 s 内大鼠在 D 象限游泳的时间, 即为空间探索时间(space exploration time,SET)。实验均在上午 8:00~12:00 内完成,并保持室内其他物体位置不变。

2。4 手术

24 h 禁食不禁水的动物用 10%的水合氯醛(4 mL·kg-1)麻醉后,固定于手术台上,腹腔取血, 断头取脑,冷冻台上快速分离双侧海马于冻存管中,液氮速冻,-80 ℃冰箱保存。Western blotting 检测 EP 管中加入裂解液( 20 mg 组织加 0.15~0.25 mL 裂解液),快速放入剪成细小碎片的海马组织, 匀浆,离心12 000 r·min-1、4 ℃、15 min),取上清液进行蛋白质定量后-80 ℃保存。BCA 试剂盒中测定上述提取样品的实际蛋白浓度。根据目的蛋白的相对分子质量选择配置 15%浓缩胶与 10%分离胶,上样(每孔 80 μg),浓缩胶 80 V、20 min,分离胶120 V、60 min,电泳至标记物溴酚兰到达凝胶底部即可。采用半干式转膜法将凝胶中的蛋白分子转移到 NC 膜上,用去离子水冲洗 NC 膜,再用丽春红预染后,将目的条带和内参条带裁剪下标记后用 TBST 洗去丽春红。放入装有 5%的脱脂奶粉液的原位杂交袋中封闭,4 ℃下过夜。用 TBST 洗涤 3 次后加入相应的一抗封闭缓冲液,4 ℃孵育过夜。再用 TBST 洗涤 3 次后加入二抗封闭缓冲液(1∶1 000),孵育 1 h(37 ℃)。显色:滤纸吸干膜上液体,放入 ECL 中进行化学发光检测。Image2X 软件扫描图片得出能反映蛋白表达强度的灰度值。

1 各组大鼠学习记忆情况结果( x ± s n=8)

2.5 统计学处理

数据分析采用统计软件 SPSS 16.0,所有计量资料以 x ± s 表示,组间比较采用单因素方差分析,t 检验,双侧检验, P<0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

pk10计划 3.1 Morris 水迷宫实验

与空白对照组比较,模型组大鼠 EL 逐渐增加,且后 3 d 差异有显著性(P<0.01 0.05),SET 显著减少(P<0.05)。与模型组比较,阳**组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠第 4 天的EL 显著缩短(P<0.05),SET 显著延长(P<0.05)。结果表明,左归降糖解郁方高剂量能显著改善糖尿病并发抑郁症大鼠的学习记忆能力,缓解抑郁。结果见表 1。

3.2 Western blotting 检测结果

与空白对照组比较,模型组 NR 受体亚型NR2A、NR2B 及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的灰度值比值显著增加(P<0.01)。与模型组比较,左归降糖解郁方高剂量组和阳**组 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的灰度值比值显著减少(P<0.01 P<0.05)。结果提示,左归降糖解郁方可有效调 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 蛋白的表达量。见表 2、图 1。



全天PK10计划两期稳定版 全天pk10计划 pk10计划 PK10在线人工计划 全天北京赛车PK10计划精准版 全天PK10计划两期稳定版 PK10在线人工计划 北京pk10计划 全天北京赛车PK10计划精准版 pk10计划全天PK10计划两期稳定版